Artículo Original

Leidys Cala Calviño ¹ , Yaixa Beltrán Delgado ² , Juan Carlos Ferrer Romero ² , Onel Fong Lores ³, David Garrido Larramendi ³

¹ Universidad de Ciencias Médicas de Santiago de Cuba. Santiago de Cuba, Cuba.

² Centro de Estudios de Biotecnología Industrial, Facultad de Ciencias Naturales y Exactas. Universidad de Oriente. Santiago de Cuba, Cuba.

³Centro de Toxicología y Biomedicina (TOXIMED). Santiago de Cuba, Cuba.

*Autor para la correspondencia: leidyscalacalvino@gmail.com

RESUMEN

Introducción: el interés actual por la lecitina de soya motiva a conocer la composición de este producto, para avalar el uso en régimen terapéutico. Objetivo: caracterizar la materia prima del suplemento nutricional LECISAN. Método:mediante un estudio analítico en el laboratorio de ciencias básicas biomédicas y elCentro de Toxicología y Biomedicinade la Universidad de Ciencias Médicas de Santiago de Cuba, entre octubre y diciembre de 2022, se identificaron los perfiles químicos de lípidos, fenoles y flavonoides, presentes en la materia prima utilizada para la fabricación del producto a través de las técnicas analíticas de separación como la cromatografía de capa delgada y el análisis espectrofotométrico. Se determinó el contenido de materia seca de acuerdo con los procedimientos referidos por la Asociación Oficial de Métodos Químicos Analíticos del 2019. Resultados: se identificó la presencia de fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina y lisofosfatidilcolina en la materia prima. El contenido de sólidos totales resultó de 7mg/ml y la cuantificación total de grasas y aceites fue 0,637 g/ml. La concentración de fenoles totales fue de 9.1635 μg ácido gálico/miligramos y de flavonoides 35.14 μg quercetina/miligramos. Conclusiones: se caracterizó la materia prima del suplemento nutricional LECISAN. Los valores medios de las concentraciones existentes de los lípidos, fenoles y flavonoides son considerados niveles de referencia en el LECISAN de estos elementos en el área investigada y pueden ser considerados direcciones interesantes para futuras investigaciones.

Palabras clave: Lecitina de soya, Polifenoles, Flavonoies, Fosfolípidos, Cromatografías de capa delgada.

ABSTRACT

Introduction: the current interest in soy lecithin motivates to know its composition, before considering its use in a therapeutic regimen. Objective: to chemically characterize the LECISAN in content of phenols, flavonoids and lipids. Materials and methods:through an analytical study, the phospholipids present in the raw material used for the manufacture of the product were identified by thin layer chromatography. The dry matter content was determined in accordance with the procedures referred to by the Official Association of Analytical Chemical Methods of 2019, total phenols by Folin-Ciocalteu reaction and flavonoids by spectrophotometry. Results: the presence of phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylserine and lysophosphatidylcholine was identified in the raw material. The total solids content was 7mg/ml and the total quantification of fats and oils was 0.637g/ml. The concentration of total phenols was 9.1635 μg gallic acid/milligrams and flavonoids 35.14 μg quercetin/milligrams. Conclusions: the mean values of the existing concentrations of lipids, phenols and flavonoids are considered reference levels in the LECISAN of these elements in the investigated area and can be considered interesting directions for future research.

Key words: Soy lecithin, Polyphenols, Flavonoids, Phospholipids, Thin layer chromatography.

INTRODUCCIÓN

Según la Food and Drug Administration (FDA), los productos naturales representan más de un tercio de todos los aprobados. ⁽¹⁾ No obstante, el Programa de las Naciones Unidas para el Medioambiente (PNUM), estima que sólo el 6% de las especies vegetales existentes han sido investigadas de forma sistemática. ⁽²⁾

La lecitina de Glycine max L. Merr (soya) perteneciente al género botánico Glycine y a la familia de las Fabaecae, es conocida y utilizada desde hace muchos siglos. ⁽³⁾ La lecitina se aisló por primera vez en 1846 por el químico y farmacéutico francés Theodore Gobley, quien en 1850 nombró de esta forma a la fosfatidilcolina obtenida de la yema de huevo. Luego, en 1874 se estableció la fórmula química completa y se demostró la presencia de lecitina en una variedad de muestras biológicas.

El Grupo de Investigadores de Innovación Tecnológica del Laboratorio Farmacéutico Oriente, registraron en calidad de suplemento nutricional el producto farmacéutico LECISAN. Fue elaborado a partir del aprovechamiento de un subproducto proveniente del proceso de refinación del aceite de frijol de soya, en la fábrica procesadora de esa leguminosa, de la provincia Santiago de Cuba. ⁽³⁾

En la actualidad realizar ensayos clínicos rigurosos, necesarios para el registro de medicamentos a partir de productos naturales, representa un gran reto. Además de las cuestiones relacionadas con patentes, cabe mencionar el actual interés de la industria farmacéutica por proteínas o ácidos nucleicos. ⁽¹⁾ Todo ello asociado a las herramientas bioinformáticas ha sido decisivo para el diseño y el desarrollo de los estudios de productos naturales. ⁽⁴⁾

El estudio de productos de origen natural declinó a principios de la década de 1990, cuando las grandes compañías farmacéuticas se reenfocaron hacia bibliotecas de compuestos sintéticos. ⁽¹⁾ Si bien la complejidad intrínseca del descubrimiento de fármacos basados en productos naturales requiere enfoques interdisciplinarios integrados, el desarrollo tecnológico y las tendencias de investigación indican que continúan entre las fuentes más importantes de nuevos fármacos en el futuro. ⁽⁴⁾

Se han desarrollado técnicas analíticas de separación, que facilitan la obtención de perfiles químicos detallados, con identificación y aislamiento de moléculas bioactivas rápida y precisa. ⁽⁵⁾ Destacan las cromatografías de capa delgada (TLC), de alta presión de líquidos (HPLC), de gases (GC), y líquida de ultra-resolución (UPLC), Ademas de técnica de análisis espectrométrico de masas (MS) y resonancia magnética nuclear (NMR).

Tras el registro del suplemento nutricional LECISAN, se ha incrementado la demanda por la población debido a las supuestas propiedades que se le atribuyen. Aun es escasa la evidencia que demuestre las potencialidades terapéuticas, por lo que hace necesario el estudio de este suplemento. ⁽³⁾

El objetivo de este trabajo es caracterizar la materia prima del suplemento nutricional LECISAN

MÉTODO

Se realizó un estudio observacional analítico en el laboratorio de ciencias básicas biomédicas y el Centro de Toxicología y Biomedicina (TOXIMED) de la Universidad de Ciencias Médicas de Santiago de Cuba, entre octubre y diciembre de 2022.

Para el estudio se tomaron muestras de lecitina de soya (materia prima del suplemento nutricional LECISAN) y se disolvió, en dimetil sulfoxido (DMSO), con un porcentaje inferior a 2%, para evitar interferencias en las reacciones químicas. Se determinó el contenido de materia seca en la materia prima, de acuerdo con los procedimientos referidos por la Asociación Oficial de Métodos Químicos Analíticos. ⁽⁶⁾

Para la obtención de perfiles químicos de lípidos, fenoles y flavonoides, se utilizaron las técnicas analíticas de separación como la cromatografía de capa delgada (TLC), y el análisis espectrofotométrico

Para separar lípidos se emplearon solventes químicos y el posterior revelado químico de la presencia de fosfolípidos por cromatografía de capa fina (TLC). ^{(7-9 )} con tres diferentes reactivos, para posterior cálculo de factores de retardo (Rf) y comparación con patrones. Los valores Rf de referencia para fosfolípidos fueron tomados de Avanti Polar Lipids, Inc. 2011. ^(10,11).

Los reactivos utilizados fueron:

Ø reactivo yodo: identifica lípidos que contengan dobles enlaces

Ø reactivo de ninhidrina: reacciona con grupos amino libres de manera muy sensible

Ø reactivo bismuto: identifica a fosfolípidos que contienen colina

El método con modificaciones, consistió en la homogenización de la materia prima empleada con agitador magnético a alta velocidad, con una mezcla metanol/cloroformo/cloruro de sodio 0.9 % en proporción 2:1:1.

Se agregó una parte de cloroformo y se dejó homogenizar por 30 minutos. Después se agregó una parte de cloruro de sodio 0.9 %, para incrementar la pureza de la muestra, y se dejó homogenizar por otros 30 minutos, para realizar filtración y centrifugación a 4000 revoluciones por minuto (rpm) que facilitó la extracción.

Quedaron separadas las fases metanólica y clorofórmica, contentiva de la mayoría de los lípidos en la materia prima. Se realizó la separación de las fases con un embudo separador, colectándose un extracto de color ámbar oscuro, traslúcido y libre de partículas en suspensión.

El análisis espectrofotométrico se utilizó para la determinación del contenido de fenoles totales se llevó a cabo según Slinkard y Singlenton ⁽¹²⁾ con el empleo del reactivo de Folin-Ciocalteu al 50 %. Se determinó la absorbancia (A) a 765 nanómetros (nm) en espectrofotómetro (T60 UV-Visible Spectrophotometer) y se comparó con una curva de calibración de ácido gálico (y=0,0152x; R²=0,9789).

El contenido de flavonoides totales se determinó por el método de Zhang et al. ⁽¹³⁾ 250 μL del extracto, se mezcló con 1,25 mL de agua destilada y 75 μL de una solución al 5 % de NaNO ₂ (Riedel-de Haén). Luego de cinco minutos, se añadió 150 μL de una solución acuosa de AlCl ₃ (Reachim) al 10 %. Transcurridos seis min, se añadieron 500 μL de NaOH 1 M y 275 μL de agua destilada. Se determinó la absorbancia (A) a 510 nm. Se utilizó catequina para la curva de calibración (y=0,0149x; R²=0,9911).

Para el análisis estadístico se utilizó el procesador estadístico Minitab® (64-bit)© 2019, versión 19.2 de Minitab. Así, fueron establecidos para determinación, la desviación estándar y la media. Para comparar valores de ensayos de cuantificación de fenoles y flavonoides totales se utilizó la prueba t-Student p <0,05 diferente.

El presente estudio es un resultado secundario de la investigación denominada “Efectos nutricionales, farmacología y toxicología preclínica del LECISAN®”, cuyo diseño general se sometió a la consideración, análisis y aprobación del Comité de Ética del Centro de Toxicología y Biomedicina de la universidad de Ciencias médicas de Santiago de Cuba, observando además lo establecido por las regulaciones de seguridad biológica. La garantía en la calidad de los experimentos realizados fue avalada por especialistas e investigadores de los centros participantes, autorizados para el desarrollo de investigaciones con este perfil.

RESULTADOS

La intensidad de las manchas obtenidas por las cromatografías de capa delgada (TLC) varió en dependencia de la concentración de fosfolípidos presentes en la muestra.

El revelado de los cromatogramas con tres diferentes reactivos (Figura. 1) resulto que:

Ø Reactivo yodo se pudo identificar fosfatidilcolina (PC) y fosfatidiletanolamina (PE).

Ø Reactivo de ninhidrina: se pudo identificar la presencia de fosfatidiletanolamina (PE) y fosfatidilserina (PS).

Ø Reactivo bismuto: se identificó la presencia de fosfatidilcolina PC y lisofosfatidilcolina (LPC).

En la figura 1 se puede observar la aparición de 2 manchas color violeta y cada uno de los valores de Rf obtenidos en cada mancha se asemeja con los valores de Rf para PE (0,74) para la mancha superior y PS (0,09) para la mancha inferior, fosfolípidos encontrados en la referencia con Rf de 0,75 y 0,12. ⁽¹¹⁾ Se observó además la aparición de dos manchas de color amarillo de las cuales los valores de Rf se asemejan con los valores de los fosfolípidos PC y LPC. ^(10,11)

Figura 1. Identificación de compuestos lipídicos de lecitina de soya por cromatografía en capa fina (TLC).

Leyenda: A: cromatoplaca obtenida de fase clorofórmica, revelado con yodo; B: cromatoplaca obtenida de fase metanólica, revelado con yodo; C: cromatoplaca obtenida de fase metanólica, revelado con ninhidrina (identificación de amino-fosfolípidos); D : cromatoplaca obtenida de fase metanólica, revelado con bismuto (identificación de fosfolípidos con colina).TG-triglicéridos; PC- fosfatidilcolina; PE-fosfatidiletanolamina; PS-fosfatidilserina; LPC-lisofosfatidilcolina

La tabla 1 muestra los valores de Rf obtenidos y patrones empleados para cada uno de los revelados cromatográficos, que permitieron identificar la presencia de fosfolípidos en la muestra estudiada. En revelado con yodo, los valores de Rf patrón de PE (0,75) y los Rf de la mancha superior (0,76), fueron similares.

El Rf de la mancha inferior (0,66) es equivalente al Rf del patrón de PC (0,67) descritos en este estudio. Se realizó además la identificación de otros componentes lipídicos en la fracción de metanol, obteniéndose la posible presencia de triglicéridos, lo cual se comprobó al comparar los Rf calculados (0,92) con los reportados en la referencia (0,9). (Tabla 1).

Tabla 1. Valores de Rf obtenidos y patrones empleados en revelados cromatográficos para identificar fosfolípidos en la lecitina de soya

*Extracción en fase metanólica ** Extracción en fase clorofórmica.

Leyenda: TG-triglicéridos; PC-fosfatidilcolina; LPC-lisofosfatidilcolina (lisolecitina); PE-fosfatidiletanolamina; PS-fosfatidilserina.

La cuantificación de aceites y grasas totales en la fase clorofórmica, mostró resultados aproximados de 0,637g/ml (Tabla 2). El contenido de sólidos totales (s.t.) resultó de 7mg/ml. La determinación de flavonoides demostró que posee 35,14 μg quercetina/miligramos (s.t.) de estos compuestos bioactivos. La concentración de fenoles totales resultó en 9,1635 μg ácido gálico/miligramos (s.t.) según reacción de Folin-Ciocalteu.

Tabla 2. Caracterización química de la lecitina de soya

p˃0,05

Leyenda: Densidad óptica de transmitancia o absorbancia (A); X– media; S– desviación estándar.

DISCUSIÓN

Los resultados de la identificación cromatográfica, coinciden con lo reportado en la literatura ^(3,14), lo que confirma la presencia de PC, PE, PS y LPC en la lecitina de soya empleada para la fabricación del LECISAN. Predominan en esta los fosfolípidos con carga positiva (colina y etanolamina). Resultaría conveniente para investigaciones posteriores realizar el estudio de lípidos no polares y neutros si se considera la cuantificación de aceites y grasas totales en la materia prima.

Colina y col. ⁽¹⁵⁾ plantean que los elevados valores de índices de acidez, peróxidos, yodo y saponificación, son indicativos de la susceptibilidad a oxidación de los lípidos presentes en el frijol de soya integral, lo que puede atribuirse al almacenamiento prolongado y expone los lípidos a un deterioro químico, oxidación y rancidez, lo que causa la pérdida de calidad de ingredientes con alto contenido de grasa.

La cuantificación de aceites y grasas totales en la fase clorofórmica, mostró resultados aproximados supera el 60 % de conformidad referida en la literatura. ⁽¹⁴⁾

El ensayo Folin-Ciocalteu se ha aplicado de gran manera en la determinación del contenido total de fenol/polifenol de alimentos de origen vegetal y muestras biológicas. Aunque los datos resultantes de los alimentos, suplementos o extractos de plantas no se pueden extrapolar a los efectos in vivo en humanos, existen estudios clínicos y de cohortes, que los correlacionan de manera inversa con los parámetros de riesgo cardiovascular, el envejecimiento y la oxidación del ADN. ⁽¹⁶⁾

Se han informado más de 8000 compuestos fenólicos de las plantas, y casi la mitad son flavonoides que han sido reportados por sus efectos antioxidantes, anticancerígenos, antibacterianos, agentes cardioprotectores, antiinflamatorios y promotores del sistema inmunológico. Varios investigadores reconocen estos componentes alimentarios mínimos en las plantas oleaginosas. ⁽¹⁷⁾

La soya contiene ocho ácidos fenólicos, a saber, ácido p-hidroxibenzoico, clorogénico, ácido cinámico, ferúlico, gentísico, salicílico, siríngico y vanílico. El ácido clorogénico se hidroliza para formar ácido caféico, que causa oscurecimiento, y pérdida de nutrientes. ^(16,17) Otro aspecto a considerar es la variación en contenido atribuido a varios factores, incluidos el cultivo, momento de la cosecha y tipos de suelo. No obstante, pueden ser considerados direcciones interesantes para futuras investigaciones.

Las principales isoflavonas de soja son la daidzeína y la genisteína. Se sugiere que pueden ejercer efectos antagonistas de los estrógenos en un ambiente con niveles altos de estrógenos, o agonistas con niveles bajos de estrógenos. Pero los mecanismos involucrados en este modo de acción dual, necesitan ser considerados. ⁽¹⁸⁾ También se ha demostrado que inhiben la activación de la vía de señalización del factor nuclear kappa B (NF-κB), relacionado con la supervivencia celular y la apoptosis. ^{(19, 20)}

Wang y col. ⁽²¹⁾, encontraron que podía modular el estrés oxidativo mitocondrial a través del mecanismo de la vía oxidativa en fibroblastos dérmicos humanos. Se plantea que pueden influenciar la osteogénesis y la osteoclastogénesis, por activación de la ruta de señalización de proteínas morfogenéticas del hueso.⁽³⁾Si se toma en cuenta esta premisa en consideración, la lecitina de soya pudiera tener efectos sobre el crecimiento y desarrollo relacionados con la presencia de fitoestrógenos.

Según la literatura consultada, la lecitina de la soya contiene 21 % de fosfatidilcolina, 22 % de fosfatidiletanolamina y 19 % de fosfatidilinositol. ⁽³⁾ El contenido informado de lisofosfatidilcolina formada tras hidrolisis intestinal es de 3,85 a 4,56 %, lisofosfatidilinositol de 0,88 a 1,36 %, lisofosfatidiletanolamina de 1,67 a 2,31 % y ácido lisofosfatídico de 1,19 a 1,34 %. El contenido de colina que se puede liberar de la fosfatidilcolina oscila entre 13,2 y 20,2 %. ⁽¹⁴⁾

Las isoflavonas son compuestos difenólicos y reconocidos fitoestrógenos (FE). Existen 230 tipos de isoflavonas, 3 de ellas (daidzeína, genisteína y gliciteína) están presentes en la soja. Para Mijiti y col. ⁽²²⁾ la daidzeína puede tener potencial antiinflamatorio a través de la inhibición de la producción de IL-6.

Wu y Liu, ⁽²³⁾ le confieren a las isoflavonas de la soya efectos antiinflamatorios, antioxidantes, anticancerígenos y protector contra la osteoporosis. De igual manera, se ha considerado un efecto inhibidor de la tirosina quinasa a través de vías de señalización NF-κB. ^{(19, 20)}

Se presentan argumentos a favor de considerarlas moduladores selectivos de los receptores de estrógeno (SERM) naturales en base a datos recientes de la unión conformacional a estos por similitudes estructurales y funcionales con los estrógenos humanos. Además, se plantea que la potencia de los fitoestrógenos determinada mediante ensayos in vitro se compara con la potencia de los estrógenos endógenos in vivo. ^(18,22)

Los polifenoles son una familia de fitoquímicos con gran diversidad química, conocidos por ser compuestos bioactivos de alimentos, especies, plantas medicinales y nutracéuticos. Se ha informado de la acción in vitro de muchos polifenoles representativos. Sin embargo, sus efectos en enfermedades de alta prevalencia son difíciles de demostrar debido a la amplia variabilidad en estructuras, acciones bioactivas y variaciones en su metabolismo por acción de la microbiota intestinal. ⁽¹⁶⁾

De manera general, se ha demostrado que la presencia de una amplia gama de compuestos fenólicos en plantas oleaginosas contribuye a sus propiedades terapéuticas. No obstante, estos compuestos se reconocen por ser las moléculas fitoquímicas más grandes con propiedades antioxidantes del reino vegetal. ⁽¹⁷⁾

CONCLUSIONES

Se caracterizó la materia prima del suplemento nutricional LECISAN. Los valores medios de las concentraciones existentes de los lípidos, fenoles y flavonoides son considerados niveles de referencia en el LECISAN y pueden ser considerados direcciones interesantes para futuras investigaciones.

CONTRIBUCIÓN DE AUTORÍA

Leidys Cala-Calviño: Conceptualización, visualización, curación de datos, análisis formal, Supervisión, Redacción-Revisión.

Yaixa Beltrán Delgado: Curación de datos, investigación.

Juan Carlos Ferrer Romero: Investigación.

Onel Fong Lores: participó Análisis Formal, curación de datos, recursos, investigación.

David Garrido Larramendi: Investigación, Redacción-Revisión.

Todos los autores aprueban la versión final del manuscrito.

FINANCIACIÓN

No se recibió financiación para el desarrollo del presente estudio.

CONFLICTOS DE INTERESES

No se declaran conflictos de intereses.

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